Advanced Photonics | 几元钱的环形LED使传统显微镜实现无标记三维层析成像

Advanced Photonics 2019年第6期封面文章：

Jiaji Li, Alex Matlock, Yunzhe Li, Qian Chen, Chao Zuo, Lei Tian. High-speed in vitro intensity diffraction tomography[J]. Advanced Photonics, 2019, 1(6): 066004

细胞作为生命活动的基本单位，其三维结构的重现一直以来都对生物医学和生命科学研究起着至关重要的作用。然而由于大部分生物细胞无色透明，采用传统明场显微术难以对其清晰成像。通常需对样本进行染色标记，如目前广泛采用的共聚焦显微技术，通过选择性地标记细胞内的特异性分子以显示细胞的结构与功能特性。利用其光学层切特性，还可在三维空间中观察细胞器与蛋白质复合物的立体结构。然而染色标记会不可避免地对细胞的正常生理过程产生不利影响；光毒性与光漂白效应也影响了对细胞的长时间连续观测；此外细胞内某些重要组分（如小分子和脂类）的特异性不高，荧光标记往往难以获得细胞整体全貌。

在研究活细胞的动态过程及其各项生理活动时, 无标记(Label-free)显微是一种最为理想的探测手段。当光通过几乎透明的物体（如细胞）时，其振幅几乎不变；然而透射光的相位则包含了关于样品的重要信息，如形貌与折射率分布。1932年，Zernike基于这种想法发明了相差显微镜：利用光的衍射和干涉特性并根据空间滤波的原理改变物光波的频谱相位，成功将相位差转换成振幅差，从而大大地提高了透明相位物体在光学显微镜下的可分辨性。相衬法的发明具有划时代的意义，Zernike因此获得1953年的诺贝尔物理学奖。时至今日，以Zernike相差(ZPC)、微分干涉相差(DIC)为代表的无标记成像技术几乎已成为了所有的生物显微镜的“标配”，作为荧光显微成像技术的亲密无间的合作伙伴，提供细胞整体的轮廓与形貌信息。

图1 生物医学中标记成像与无标记成像方法的对比（图片均来自网络）。

半个多世纪来，Zernike的思想仍然给人们带来源源不断的感悟和启发，新型的无标记显微技术不断涌现，其中“定量相位成像”技术可以说是其中最有前景的技术之一。区别于传统相差显微镜只能够定性提升强度对比，定量相位显微技术能够对由样品物理厚度和折射率系数所决定的相位信息进行准确量化与测量。通过将定量相位成像技术与计算机断层扫描技术相结合（如旋转物体，光束扫描等），还可以实现类似于共聚焦显微镜的层析成像，获取细胞内部的“真三维”折射率信息。然而这些相位成像技术往往需要借助于光干涉测量原理，高度相干性光源（如激光）、复杂的干涉与机械扫描装置使其难以兼容现有的光学显微镜系统。

图2 全息干涉显微层析技术，采用入射光扫描或者待测物体选择的方式来实现三维信息重构；但复杂的干涉光路结果，对环境振动敏感和高相干性光源的散斑噪声限值了成像质量。

最近，中国南京理工大学与美国波士顿大学的研究人员合作提出了一种新型的无标记层析显微技术，称为环形照明强度衍射层析(aIDT)，相关成果以High-speed in vitro intensity diffraction tomography为题发表在Advanced Photonics上。环形照明强度衍射层析技术仅需在传统显微镜上附加一个价值1美元的环形可编程LED光源模块，而无需对显微镜本身进行任何更改，便可使其与实验室中的任何生物显微镜相兼容。环形可编程LED光源位置与显微物镜的数值孔径严格匹配，不同LED从8个角度依次照射待测样品，拍摄样品的强度图像，再通过4D反卷积就可以从这些强度图像中重建样品的三维折射率分布，成像方法示意图如图3所示。

图3 基于环形编码照明的强度衍射层析成像方法示意图；（a）传统明场显微镜与环形LED照明单元；（b）环形编码照明光源与物镜光瞳严格匹配；（c）测量每个角度下被物体散射之后的光线强度；（d）在不同角度和不同轴向位置上的吸收和相位传递函数。

环形编码LED照明能够以最少的数据量获取最大的频谱覆盖率与相位传递函数响应，并且可以达到非相干衍射极限的轴向/横向分辨率。基于所构建的环形照明显微系统（40倍放大率，0.65数值孔径的显微物镜），研究人员在350 μm×100 μm×20 μm 的体积范围实现了无标记生物样本的动态三维衍射层析成像，成像的速度为10.6 Hz，三维重构的横向和轴向成像分辨率分别为487 nm和3.4 μm。图4展示了利用环形编码照明的强度显微层析成像技术恢复出的动态秀丽隐杆线虫折射率分布结果，其中(a)为单个照明角度下拍摄的原始强度图像；(b)为恢复出的线虫三维结构的中心折射率切片分布；(c)为三维折射率分布经过深度彩色编码后的折射率分布结果。

图4 利用环形编码照明的强度显微层析成像技术恢复出的动态秀丽隐杆线虫重构结果；(a)拍摄的原始强度图像；(b)恢复出的三维结构的中心折射率切片分布；(c)深度彩色编码后的折射率分布结果。

相比于传统的光学层析成像技术，该技术具有以下三大优点：

1）只需采用环形LED作为编码照明，无需激光等相干光源；

2）兼容传统明场显微镜，无需干涉成像装置，不依赖于任何机械扫描；

3）成像速度快，可对动态生物样品实现 10 Hz的动态三维成像。

该技术借助于环形编码照明赋予了传统显微镜崭新的视野：它能够在三维空间尺度上对无标记的动态生物样本提供亚微米分辨率的三维折射率断层影像，这为生命科学与生物医学研究提供了一种非侵入、高性能、低成本、定量化、简单普适的影像学工具。就如同相差显微镜与荧光显微镜之间的关系一般，环形照明强度衍射层析有望成为目前广泛采用的荧光共聚焦显微技术的“新搭档”，为其提供互补的细胞三维形态与折射率信息。接下来，研究人员希望利用高数值空间照明与探测进一步提升其成像的空间分辨率，并探索其在细胞生物学、生理病理学以及免疫肿瘤学等领域中新的应用。[1] Park Y, Depeursinge C, Popescu G. Quantitative phase imaging in biomedicine[J]. Nature Photonics, 2018, 12(10): 578–589.[2] Zuo C, Sun J, Li J, 等. High-resolution transport-of-intensity  quantitative phase microscopy with annular illumination[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 7654.

[3] Li J, Chen Q, Zhang J, 等. Efficient quantitative phase microscopy using programmable annular LED illumination[J]. Biomedical Optics Express, 2017, 8(10): 4687–4705.

[4] Ling R, Tahir W, Lin H-Y, 等. High-throughput  intensity  diffraction  tomography  with a computational microscope[J]. Biomedical Optics Express, 2018, 9(5): 2130. 

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